Activin A、Inhibin A在 子宫内膜异位症中的表达 及意义 专 业：妇产科学 研究生：李红云 导 师：黄凤英副教授 1 主要内容 第一章 前 言 第二章 材料与方法 第三章 结 第四章 附 果 图 第五章 讨 第六章 结 论 论 2 前 言 第一章 前 言 3 前 言 研 究 背 景 4 前 言 子宫内膜异位症(endometriosis,EMs) ，简称內异症，是指具有活性的子宫内 膜组织（腺体和间质）出现在子宫内膜 以外部位。 5 前 言 內异症是育龄期妇女的多发病、常见病 不孕 痛经、慢性 盆腔疼痛 月经异常、 盆腔包块 影响生活质量 6 前 言 其发病机制至今尚未阐明，且复发率 高，治疗棘手，国内外妇产科学者一 直在努力探索其发病机制，以利于这 一疾病的治疗而成为妇产科医学研究 的热点和难点。 7 前 言 內异症发病机制现有学说 3A模式学 说 子宫内膜 种植学说 免疫学说 淋巴及静 脉播散学 说 体腔上皮 化生学说 8 內异症 其他学说 学说 前 言 “3A模式学说”：月经期返流的子宫内膜需要黏 附（Attachment）、（Aggression），并诱 导新生血管形成（Angiogenesis），最终发展成 为有临床症状的疾病。 內异症 生根 生长 生病 9 前 言 “免疫学说”认为：内异症是一种自身免疫性疾 病，机体免疫功能逐渐减退，子宫内膜细胞如同 肿瘤细胞一样可能发生免疫逃逸，对异位内膜细 胞的性免疫减弱，免疫、清除异位细胞 能力下降，使异位内膜得以存活、增殖并导致局 部纤维增生、粘连。 10 前 言 Activin A (激活素A) 垂体 是一种主要 由性腺分泌 的大糖 蛋白，属于 生长因 前列腺 子β（TGF 卵巢 -β）超家 族球蛋白成 胎盘 员。 Activin A存在于 肝脏 脑 胰腺 非生 生殖 殖组 组织 织 肾上腺 11 肾脏 骨髓 子宫内膜 前 言 Activin A Activin A 纤维连接蛋白,结 粘附性↑ 缔组织生长因子↑ 上皮型钙粘蛋白↓， MMP-2、3、7、9和 性↑ 白血病因子↑ 促进增殖 Activin A 促进血管形成 12 前 言 内异症是具有类似恶性肿瘤的生物学行为的良性病变,子 宫内膜细胞的粘附、、增殖能力及血管形成对內异 症的发病具有极其重要的作用，Activin A虽具有以上生 物学作用,但是目前国内外关于Activin A的研究主要集 中在PCOS、子痫前期、卵巢肿瘤等妇产科疾病和内科的 纤维增生性疾病,而其在內异症方面的研究并不多,仅国 外少数学者有研究,国内尚无內异症方面的研究。 13 前 言 Inhibin A（素A）与Activin A一 样，同是大糖蛋白，也属于生 长因子β（TGF-β）超家族球蛋白成 员。 14 前 言 最初对其生物学作用的认识是反馈性垂体FSH 的分泌并影响卵泡的生长发育，后来发现其也具有 生长因子样作用，在组织再生中调控组织细胞的生 长和分化,而且Inhibin A在细胞免疫中也起作用。 而Inhibin A在内异症方面的研究，虽国外已有报 道，但国内尚处于空白阶段。 15 前 言 二者在內异症的表达如何？是否对內异症 的发生发展起作用？二者是否存在相互关 系？都值得我们研究和探讨。 ？ 16 前 言 研 究 目 的 17 前 言 免疫组化SP法 检测Activin A和Inhibin A蛋白在內 异症组异位内膜、在位内膜及对照组正常 子宫内膜中的表达。 探讨Activin A和Inhibin A在內异症 发病中的作用及相互关系。 18 材料与方法 第二章 材料与方法 19 研 究 对 象 Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期21例 异位内膜 实 （32例） 分泌期16例 增生期16例 材料与方法 验 组 在位内膜 增生期16例 （32例） 分泌期16例 各组患者年龄无统计学差异， 月经周期规则，无其他内分 泌、免疫及代谢性疾病，术 前6个月内未接受激素治疗。 对 增生期18例 正常内膜 照 （34例） 分泌期16例 组 输卵管吻合术、不孕 症（输卵管因素）、 卵巢囊肿。 20 材料与方法 主要仪器 普通光学显微镜 TGW16高速微型离心机 LGE-10-400H超纯水机 盖玻片 载玻片 DR28429精密可调微量移液器 微波炉 BL-220H电子天平 4 ℃冰箱 移液器管咀 塑料修复盒 21 主要试剂 即用型封闭用兔血清 即用型封闭用羊血清 浓缩型羊抗人Activin A多克隆抗体 材料与方法 30%过氧化氢 柠檬酸缓冲液 EDTA抗原修复液 二甲苯 无水乙醇 松节油 无水磷酸氢二钠 氯化钾 磷酸二氢钾 氯化钠 22 即用型兔抗人Inhibin A多克隆抗体 浓缩型兔抗羊IgG-HRP 即用型羊抗兔IgG-HRP 辣根酶标记链霉卵白素工作液 AEC显色试剂盒 苏木素 甘油明胶 实验步骤 组织切片 滴加一抗工作 液，4℃过夜 切片常规脱 蜡至水化 滴加封闭用血清 工作液,室温10-15 分钟,倾去,勿洗 材料与方法 滴加3%H2O2 室温10分钟 高压抗原修复 AEC显色剂显色, 苏木素复染 滴加辣根酶标记链 滴加二抗工作液, 霉卵白素工作液， 室温10-15分钟 室温10～15分钟 封片 镜检 23 材料与方法 免疫组化结果判定 Activin A和Inhibin A蛋白的阳性信号均为细胞浆内出现红 色颗粒,用已知阳性片作阳性对照,PBS代替一抗作阴性对照 。 染色强度 无着色 浅着色 中等着色 强着色 0 1 2 3 阳性细胞数 5% 0 1 2 + 5-10% 11-50% = 免 疫 组 化 积 分 50% 3 24 统计分析 材料与方法 实验数据运用SPSS17.0统计软件进行统计分析， 计量资料采用均数±标准差表示，先进行正态性 检验 符合正态分布的两组间的均数比较采用两样本t 检验，多组间的均数比较采用单因素方差分析 （One-way ANOVA），两测量指标的相关性采用 pearson相关分析 检验水准α=0.05(双尾)，P0.05表示有显著性 差异。 25 结 果 第三章 结 果 26 Activin A蛋白的表达 表 3-1 Activin A蛋 白 在 各 组 内 膜 中 表 达 的 比 较 （ x ± S） 组别 內异症组 异位内膜 在位内膜 对照组 正常内膜 a 6 结 果 P 值 例数 32 32 免疫组化积分 4.347± 1.569 3.156± 1.500 ab F值 c 20.323 0.000 34 b 2.124± 1.162 c 与 在 位 内 膜 比 较 ： P=0.001； 与 正 常 内 膜 比 较 ： P=0.000； 与 正 常 内 膜 比 较 ： P=0.004。 5 免疫组化积分 4 3 2 1 0 异位内膜 在位内膜 正常内膜 图 3-1 Activin A 蛋 白 在 各 组 内 膜 中 表 达 的 比 较 （ x ± S） 27 Activin A蛋白的表达 结 果 表 3-2 Activin A蛋 白 在 异 位 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 月经分期 增生期 分泌期 例数 16 16 免疫组化积分 3.556± 1.530 5.138± 1.189 t值 -3.265 P值 0.003 7 6 5 免疫组化积分 4 3 2 1 0 增生期 分泌期 图 3-2 Activin A 蛋 白 在 异 位 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 28 Activin A蛋白的表达 结 果 P值 0.004 表 3-3 Activin A蛋 白 在 在 位 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 月经分期 增生期 分泌期 例数 16 16 免疫组化积分 2.419± 1.121 3.894± 1.494 t值 -3.158 6 5 免疫组化积分 4 3 2 1 0 增生期 分泌期 图 3-3 Activin A 蛋 白 在 在 位 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 29 Activin A蛋白的表达 结 果 P值 0.000 表 3-4 Activin A蛋 白 在 正 常 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 月经分期 增生期 分泌期 例数 18 16 免疫组化积分 1.483± 0.933 2.844± 0.968 t值 -4.170 4 3.5 3 免疫组化积分 2.5 2 1.5 1 0.5 0 增生期 分泌期 图 3-4 Activin A 蛋 白 在 正 常 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 30 Activin A蛋白的表达 结 果 P值 0.021 表 3-5 Activin A蛋 白 在 內 异 症 r-AFS不 同 分 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） r-AFS 分 期 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ～Ⅳ期 6 例数 11 21 免疫组化积分 3.482± 1.701 4.800± 1.319 t值 -2.430 5 免疫组化积分 4 3 2 1 0 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ～Ⅳ期 图 3-5 Activin A 蛋 白 在 內 异 症 r-AFS 不 同 分 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 31 Inhibin A蛋白的表达 表 3-6 Inhibin A蛋 白 在 各 组 内 膜 中 表 达 的 比 较 （ x ± S） 组别 內异症组 异位内膜 在位内膜 对照组 正常内膜 a 6 结 果 P 值 例数 32 32 免疫组化积分 4.109± 1.550 3.103± 1.480 ab F 值 c 16.180 0.000 34 b 2.112± 1.634 c 与 在 位 内 膜 比 较 ： P=0.006； 与 正 常 内 膜 比 较 ： P=0.000； 与 正 常 内 膜 比 较 ： P=0.006。 5 免疫组化积分 4 3 2 1 0 异位内膜 在位内膜 正常内膜 图 3-6 Inhibin A 蛋 白 在 各 组 内 膜 中 表 达 的 比 较 （ x ± S） 32 Inhibin A蛋白的表达 结 果 P值 0.003 表 3-7 Inhibin A蛋 白 在 异 位 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 月经分期 增生期 分泌期 6 例数 16 16 免疫组化积分 3.325± 1.464 4.894± 1.230 t值 -3.282 5 免疫组化积分 4 3 2 1 0 增生期 分泌期 图 3-7 Inhibin A 蛋 白 在 异 位 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 33 Inhibin A蛋白的表达 结 果 P值 0.002 表 3-8 Inhibin A蛋 白 在 在 位 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 月经分期 增生期 分泌期 5 4.5 4 3.5 例数 16 16 免疫组化积分 2.338± 1.227 3.869± 1.331 t值 -3.383 免疫组化积分 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 增生期 分泌期 图 3-8 Inhibin A蛋 白 在 在 位 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 34 Inhibin A蛋白的表达 结 果 表 3-9 Inhibin A蛋 白 在 正 常 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 月经分期 增生期 分泌期 例数 18 16 免疫组化积分 1.556± 0.946 2.738± 1.256 t值 -3.121 P值 0.004 4 3.5 3 免疫组化积分 2.5 2 1.5 1 0.5 0 增生期 分泌期 图 3-9 Inhibin A蛋 白 在 正 常 内 膜 增 生 期 、 分 泌 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 35 Inhibin A蛋白的表达 结 果 P值 0.028 表 3-10 Inhibin A蛋 白 在 內 异 症 r-AFS不 同 分 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） r-AFS 分 期 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ～Ⅳ期 例数 11 21 免疫组化积分 3.291± 1.553 4.538± 1.399 t值 -2.307 6 5 免疫组化积分 4 3 2 1 0 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ～Ⅳ期 图 3-10 Inhibin A 蛋 白 在 內 异 症 r-AFS 不 同 分 期 表 达 的 比 较 （ x ± S） 36 Activin A与Inhibin A相关关系 结 7 果 6 6 6 5 A 免 疫 组 化 积 分 A 免 疫 组 化 积 分 A 免 疫 组 化 积 分 Inhibin 5 5 4 4 4 3 3 Inhibin 3 Inhibin 2 2 2 1 1 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0 0 1 2 3 4 5 6 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Activin A 免 疫 组 化 积 分 图3-11 Activin A 蛋白和Inhibin A蛋 白在异位内膜中表 达的相关性分析 r=0.925，P＜0.05 图3-11 Activin A 蛋白和Inhibin A蛋 白在在位内膜中表 达的相关性分析 r=0.924，P＜0.05 Activin A 免 疫 组 化 积 分 图3-11 Activin A 蛋白和Inhibin A蛋 白在正常内膜中表 达的相关性分析 r=0.893，P＜0.05 Activin A 免 疫 组 化 积 分 呈正相关关系 37 附 图 第四章 附 图 38 以下图片为HE染色，×200 附 图 图1內异症异位内膜增生期 图2內异症异位内膜分泌期 图3內异症在位内膜增生期 图4內异症在位内膜分泌期 图5正常子宫内膜增生期 图6正常子宫内膜分泌期 39 以下图片为免疫组化AEC染色，×200 附 图 图7 Activin A蛋白在前列 图8 Activin A蛋白在子宫 图9 Activin A蛋白在內异 症异位内膜增生期呈强阳性 腺增生症组织中的阳性表 内膜组织中的阴性表达 表达 达（阳性对照） （阴性对照） 图10 Activin A蛋白在內异 图11 Activin A蛋白在內异 图12 Activin A蛋白在內异 症异位内膜分泌期呈强阳性 症在位内膜增生期呈阳性表 症在位内膜分泌期呈阳性表 表达 达 达 40 以下图片为免疫组化AEC染色，×200 附 图 图13 Activin A蛋白在正常 图14 Activin A蛋白在正常 图15 Inhibin A蛋白在肾上 子宫内膜组织增生期呈弱阳 子宫内膜组织分泌期呈弱阳 腺皮质腺瘤组织中的阳性表 性表达 性表达 达（阳性对照） 图16 Inhibin A蛋白在子宫 图17 Inhibin A蛋白在內异 图18 Inhibin A蛋白在內异 内膜组织中的阴性表达（阴 症异位内膜增生期呈强阳性 症异位内膜分泌期呈强阳性 性对照） 表达 表达 41 以下图片为免疫组化AEC染色，×200 附 图 图19 Inhibin A蛋白在內异 症在位内膜增生期呈阳性表 达 图20 Inhibin A蛋白在內异 症在位内膜分泌期呈阳性表 达 图21 Inhibin A蛋白在正常 子宫内膜组织增生期呈弱阳 性表达 图22 Inhibin A蛋白在正常 子宫内膜组织分泌期呈弱阳 性表达 42 讨 论 第五章 讨 论 43 Activin A和Inhibin A的结构 讨 论 Activin A、Inhibin A均为生长 因子β(TGF-β)超家族球蛋白。 InhibinβA -S-S- InhibinβA Inhibin α -S-S- InhibinβA Activin A Inhibin A 44 Activin A的作用 纤维连接蛋白、结 缔组织生长因子↑ 讨 论 细胞粘附 性 细胞 性 细胞增殖 上皮型钙粘蛋白↓ MMP-2、3、7、9和 白血病因子↑ Activin A 旁 分 泌 作 用 VEGF和VEGF受体↑， 作为自分泌因子增 强VEGF的作用 血管形成 45 Activin A在各组内膜的表达 异位 在位 正常 讨 论 各组内膜都 能 产 生 Activin A, 与国外学者 R e i s 和 Mabuchi的 研究结果相 似。 內异症组异位和 在位内膜较正常 内膜能产生更多 的Activin A,说 明其在內异症的 发病中可能起作 用,与Rombauts的 研究结果一致。 Activin A在异 位内膜高表达可 能通过增加细胞 粘附性、 性、增殖能力， 并促进血管形成 而促进內异症发 生。佐证了“3A 发病模式”。 46 Activin A在月经周期的表达 讨 论 Activin A蛋白在正常内膜:分泌期＞增生期,与Ciarmela 的研究结果一致,提示分泌期的子宫内膜细胞较增生期子 宫内膜细胞能产生更多的Activin A。 我们还发现：Activin A蛋白在內异症组异位内膜和在位 内膜：分泌期＞增生期，提示Activin A蛋白在腺上皮细 胞中的周期性表达似与卵巢激素的周期性分泌相关,可能 与雌、孕激素的调节有关。 47 Activin A在不同临床分期的表达 Ⅲ～Ⅳ期＞Ⅰ～Ⅱ期 讨 论 与病情严重程度相关 随着內异症病变的发展，异位病灶与 周围组织器官形成过度纤维化，可导 致瘢痕形成、慢性盆腔疼痛以及受累 的组织器官功能减弱甚至散失，为卵 巢异位囊肿的临床特征之一。 研究表明Activin A能通过促进Ⅰ型 胶原的表达促进肝纤维化、肾纤维 化、肺纤维化的发生和发展。 已有研究Ⅰ型胶原是內异症纤 维化最主要的因子。 推 测 Activin A也可 能通过增加Ⅰ 型胶原的表达 促进內异症纤 维化进展，从 而加重病情, 是內异症发展 中的一个重要 因素。 48 Inhibin A的作用 讨 论 Inhibin A可减少Ⅱ型 主要组织相容性复合 物(MHCⅡ)的表达, MHC Ⅱ 是 抗 原呈现 和 T 细胞通过T细胞受体活 化所必需的,其表达减 少则导致T细胞反应降 低,从而降低免疫反应, 而且Inhibin A还可抑 制免疫活性细胞(如巨 噬细胞)的补充和活化 Findlay研究发现 Inhibin与Activin、 TGF-β、巨噬细胞游 走因子等都是转 化生长因子 β 超家族 ,具有自分泌、旁 分泌生长因子活性 ， 参与垂 体、 性 腺 、胎 盘等多种组织细胞的 生长和分化。 49 Inhibin A在各组内膜的表达 异位 在位 正常 讨 论 表明各组内膜都能产生Inhibin A,与国外学者Reis、 Akande的研究结果一致。 不仅如此，我们的结果还表明內异症组异位内膜较在位 内膜和正常内膜能产生更多的Inhibin A，在位内膜较 正常内膜也能产生更多的Inhibin A，可能是內异症发 生发展的原因之一。 50 讨 论 Inhibin A 异位内膜 高表达 生长因子 样作用 内异症的发生 降低免疫 反应 51 Inhibin A在月经周期中的表达 讨 论 本研究发现Inhibin A蛋白在各组 内膜的表达：分泌期＞增生期,与 Anderson和Klein的研究结果一致，提 示Inhibin A分泌高峰在黄体期。 52 Inhibin A在不同临床分期的表达 讨 论 本研究结果还显示Inhibin A蛋白在內 异症Ⅲ～Ⅳ期的表达强于Ⅰ～Ⅱ期。提示 內异症患者Inhibin A蛋白表达水平与內异 症的进展有关。 53 Activin A与Inhibin A的相互关系 我们的实验：二者在 各组内膜均存在正相 关关系（P0.05） 讨 论 Activin A Inhibin A Activin A和Inhibin A在內异症发病中可 能存在协同作用，但具体作用机制值得进一步 研究探讨。 54 结 论 第六章 结 论 55 结 论 1 Activin A和Inhibin A在內异症表达增强，提示 Activin A和Inhibin A可能参与內异症发病； 2 Activin A和Inhibin A在各组子宫内膜组织中的 表达与月经周期有关； 3 Activin A和Inhibin A的表达与內异症临床分期 有关，提示二者可能参与內异症的发展； 4 Activin A和Inhibin A在各组子宫内膜组织中的 表达水平呈正相关关系，提示二者在內异症的发生 发展过程中有协同作用。 56 致 谢 三年的硕士生涯马上就要过去，回忆起这三年的点点滴滴，感触很深， 在此，我要衷心的感谢每一位关心和帮助过我的人们！ 首先衷心感谢我的导师黄凤英副教授对我学习、工作上的悉心 和生活上的关心和照顾。严谨的治学态度、缜密的科学思维、渊博的知 识、的医德、精湛的医术和对事业的追求，是我终生学习的榜样。 每次回想起为了学生的事情，哪怕是白天辛苦一天，晚上再晚 也不忘为我们的事情操劳，我的心就一次次被震撼着，，谢谢您！您很 伟大！我们很幸福！能成为您的学生是我这一生莫大的财富！ 衷心感谢中南大学湘雅二医院妇产科的方小玲、、吴宜林、张洪 文、陶光实、朱付凡、丁依玲、、刘毅智、施晓波、黄健、符淳、邓 文、、皮丕湘、吴献青、范红、聂妹芳、彭梅、王丽琼、喻玲、邓娅莉 、丁晖、宋婉娟、花兰、李菡、杨元娟、熊晶、章婷婷、施华芳、徐润芝、 邹燕辉等各位老师对我学习和生活的指导和关心。感谢妇科全体老师在我实 验收集标本中给予的大力帮助！ 衷心感谢中南大学湘雅二医院病理科老师对我的帮助与支持！ 衷心感谢师姐、邹颖、王焕萍、刘玉娟、邵文静，师妹胡柏帆， 同学杨倩、贺艳丽、旭、王常青在实验过程中的热情帮助！ 衷心感谢在百忙之中抽出时间审阅本论文的专家教授，感谢答辩委员会 的各位老师和专家们对我的论文提出的宝贵！ 衷心感谢我的爱人和我的亲人在学习上和生活中对我的理解、支持与帮 助！ 衷心感谢各位患者在课题实施过程中对我的支持！ 57 再次衷心感谢所有帮助过我的良师益友和亲人们！midd-993